小動物活體成像主要采用生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標記細胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進行標記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標（標記細胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外, 這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度*，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。

一、
技術(shù)原理

1.  標記原理

哺乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素（luciferin），即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標記細胞的數(shù)目線性相關(guān)。對于細菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物。

基因、細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。標記細胞的方法基本上是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細胞株。目前, 常用的細胞株基本上都已標記好, 市場上已有銷售。 將標記好的細胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標記的細胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，中科愷盛公司生產(chǎn)的在體生物光學(xué)分子成像系統(tǒng)，應(yīng)用一個高度靈敏的制冷CCD相機及特別設(shè)計的成像暗箱和成像軟件，可觀測并記錄到這些光子。

2.  光學(xué)原理

光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。在相同的深度情況下, 檢測到的發(fā)光強度和細胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強度，同時反映出細胞的數(shù)量。

3.  實驗過程

通過分子生物學(xué)克隆技術(shù), 應(yīng)用單克隆細胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細胞株。

典型的成像過程是：小鼠經(jīng)過麻*醉系統(tǒng)被麻*醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝*次背景圖。下一步，自動關(guān)閉照明燈, 在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)出的光，即為生物發(fā)光成像。 與*次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。

4．熒光成像功能

熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報告基團，標記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測生理指標的*選擇。

雖然熒光信號遠遠強于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠遠低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難*消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來研究活體動物體內(nèi)成像。但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標記靶點多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。zui近許多文獻報道的實驗中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細胞或動物進行雙重標記，用成熟的熒光成像技術(shù)進行體外檢測，進行分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進行動物體內(nèi)檢測，進行活體動物體內(nèi)研究。

上海恒遠ELISA試劑盒供應(yīng)商是一家生物技術(shù)企業(yè)，公司集經(jīng)銷批發(fā)ELISA試劑盒,人ELISA試劑盒，大鼠ELISA試劑盒，小鼠ELISA試劑盒為一體的有限責(zé)任公司，是一家經(jīng)國家相關(guān)部門批準注冊的企業(yè)。ELISA試劑盒,生物試劑,進口培養(yǎng)基,胎牛血清,抗體等產(chǎn)品已國內(nèi)大部分地區(qū) ，銷售額逐年穩(wěn)步上升。

二、
技術(shù)應(yīng)用

通過活體動物體內(nèi)成像系統(tǒng)，可以觀測到疾病或癌癥的發(fā)展進程以及藥物治療所產(chǎn)生的反應(yīng)，并可用于病毒學(xué)研究、構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質(zhì)相互作用研究以及細胞體外檢測等領(lǐng)域。具體應(yīng)用如下：

1.  標記細胞

（1）
癌癥與抗癌藥物研究

直接快速地測量各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估。活體生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤。

（2）
免疫學(xué)與干細胞研究

將熒光素酶標記的造血干細胞移植入脾及骨髓，可用于實時觀測活體動物體內(nèi)干細胞造血過程的早期事件及動力學(xué)變化。有研究表明，應(yīng)用帶有生物發(fā)光標記基因的小鼠淋巴細胞，檢測放射及化學(xué)藥物治療的效果，尋找在腫瘤骨髓轉(zhuǎn)移及抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細胞機制。應(yīng)用可見光活體成像原理標記細胞，建立動物模型，可有效的針對同一組動物進行連續(xù)的觀察，節(jié)約動物樣品數(shù)，同時能更快捷地得到免疫系統(tǒng)中病原的轉(zhuǎn)移途徑及抗性蛋白表達的改變。

（3）
細胞凋亡

當(dāng)熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產(chǎn)生的融合蛋白無熒光素酶活性，細胞不能發(fā)光，而當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，活化的caspase-3在特異識別位點切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，由此可用于觀察活體動物體內(nèi)的細胞凋亡相關(guān)事件。

2.  標記病毒

（1）病毒侵染

以熒光素酶基因標記的HSV-1病毒為例，可觀察到HSV-1病毒對肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵和病毒從血液系統(tǒng)進入神經(jīng)系統(tǒng)的過程。多種病毒，腺病毒，腺相關(guān)病毒，慢病毒，乙肝病毒等，已被熒光素酶標記，用于觀察病毒對機體的侵染過程。

（2）基因治療

基因治療包括在體內(nèi)將一個或多個感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到靶細胞?？蓱?yīng)用熒光素酶基因作為報告基因用于載體的構(gòu)建，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內(nèi)持續(xù)和組織特異性表達。這種非侵入方式具有容易準備、低毒性及輕微免疫反應(yīng)的優(yōu)點。熒光素酶基因也可以插入脂質(zhì)體包裹的DNA分子中, 用來觀察脂質(zhì)體為載體的DNA運輸和基因治療情況。

3.  標記細菌

（1）細菌侵染研究

可以用標記好的革蘭氏陽性和陰性細菌侵染活體動物, 觀測其在動物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對外界因素的反應(yīng)。

（2）抗生素藥物

利用標記好的細菌在動物體內(nèi)對藥物的反應(yīng)，醫(yī)藥公司和研究機構(gòu)可用這種成像技術(shù)進行藥物篩選和臨床前動物實驗研究。

4. 基因表達和蛋白質(zhì)相互作用

（1）組織特異性基因表達

熒光素酶（luciferase）是一類生物發(fā)光酶，其中的renilla熒光素酶和firefly熒光素酶分別識別不同的底物, 一種細胞可被這兩種熒光素酶標記: renilla 熒光素酶基因由一組成性穩(wěn)定表達的啟動子驅(qū)動, 作為內(nèi)參，反應(yīng)細胞數(shù)量的變化; firefly熒光素酶基因由要研究的組織特異性啟動子驅(qū)動。這樣firefly熒光素酶發(fā)光信號的變化，在消除細胞數(shù)量變化的影響后就可反應(yīng)特定的啟動子在動物體內(nèi)的表達活性。

（2）蛋白質(zhì)相互作用

觀察細胞中或活體動物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)的相互作用，是將熒光素酶基因分成兩段，分別連接所研究的兩種蛋白之一的編碼DNA，然后導(dǎo)入細胞或動物體內(nèi)表達為融合蛋白。當(dāng)兩種蛋白有強相互作用時，表達的熒光素酶兩部分相互靠近形成有活性的熒光素酶，在有底物存在時出現(xiàn)生物發(fā)光，反映出所研究的兩種蛋白存在相互作用。應(yīng)用此原理亦可用于研究細胞信號傳導(dǎo)途徑。

（3）阻斷RNA

通過對比生物發(fā)光的變化，驗證在成年小鼠體內(nèi)，注射雙鏈siRNA可以特異地阻遏基因表達。

5.  轉(zhuǎn)基因動物模型

（1）
基因表達

為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩(wěn)定整合于實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。利用其表達產(chǎn)生的熒光素酶與底物作用產(chǎn)生生物發(fā)光，反應(yīng)目的基因的表達情況，從而實現(xiàn)對目的基因的研究。可用于研究動物發(fā)育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導(dǎo)特定基因表達，以及其它生物學(xué)事件引起的相應(yīng)基因表達或關(guān)閉。

（2）
各種疾病模型

研究者根據(jù)研究目的，將靶基因、靶細胞、病毒及細菌進行熒光素酶標記，同時轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)形成所需的疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等等?？商峁┌谢蛟隗w內(nèi)的實時表達和對候選藥物的準確反應(yīng)，還可以用來評估候選藥物和其它化合物的毒性。為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。